【基因检测，人人可及】基因检测百问百答之ALK检测

ALK（间变性淋巴瘤激酶）基因融合是非小细胞肺癌一个重要的临床亚型，在我国非小细胞肺癌中的发生率约5%。近年来ALK抑制剂的研发和临床应用取得了较大的突破，包括一代克唑替尼、二代色瑞替尼、阿来替尼、布加替尼和恩沙替尼以及三代劳拉替尼，ALK阳性晚期非小细胞肺癌患者无进展生存时间可以获得显著延长。然而，ALK基因融合形成机制多样，检测方法众多，不同方法各有优缺点，如何准确、快速、恰当的使用ALK检测方法，筛选出适用ALK抑制剂适用的获益人群具有重要临床意义。
ALK基因突变检测什么？
ALK基因突变是指ALK基因发生了融合、点突变或扩增等异常，导致ALK蛋白的异常激活，从而促进细胞生长和分裂，成为肿瘤的驱动基因。ALK融合在肺癌的发生频率约为5%，目前已报道有20多种变体亚型，最常见的融合形式为EML4-ALK，其中60%以上的EML4-ALK融合亚型为变体1（EML4第13号外显子与ALK第20号外显子融合）和变体3（EML4第6号外显子与ALK第20号外显子融合），ALK基因还可能与KIF5B、TFG、DCTN1、SQSTM1、TPR、STRN、CLTC等基因发生融合等。

与 EGFR 点突变类型相比，ALK基因融合突变模式更为复杂，已发现的所有ALK基因融合突变是在ALK基因外显子20处发生断裂，而EML4断裂点有外显子2/6/13/14/15/17/18/20, 因此ALK 融合突变的检出需要覆盖其断裂点（20号外显子），甚至新的断裂点、融合伴侣基因最好全面覆盖，除此之外 ALK基因还存在点突变或扩增，综上ALK 基因突变是非常复杂的，检测时明确的融合断点区域和点突变区域需要全面覆盖，才能保证ALK基因突变准确的检出。

ALK 基因突变怎么测？
目前ALK融合检测共识推荐使用Ventana-D5F3 IHC、FISH、qRT-PCR和二代测序方法。
1.ALK 基因检测免疫组化方法分为: 非Ventana-D5F3 抗体IHC和Ventana-D5F3 IHC。非 Ventana-D5F3抗体 IHC仅用于初筛。VentanaD5F3 IHC 法是目前最快速、经济、并且二元结果判读标准简便易行，且具有较高的灵敏度（100%）及特异性（98%）。该判读标准仅适用于肺腺癌，该检测在用于鳞癌、神经内分泌癌等其他类型肺癌标本时应谨慎，疑似阳性标本需要使用其他方法进行验证。
2.荧光原位杂交FISH被认为是ALK融合/重排突变检测的金标准, 敏感度和特异性均相对较高，新鲜组织和石蜡包埋组织都可以用于FISH检测。FISH检测结果只有阴性和阳性结果，不能鉴别具体的融合类型，且 FISH 结果信号判读时对诊断医师要求很高，对于一些阈值附近的病例和不典型信号病例的错误判读容易造成结果假阴性或假阳性。
3.荧光定量PCR（RT-PCR）是一种快速简便的检测方式，其利用DNA/RNA复制原理，用特异性的上/下游引物将目标片段（比如ALK基因中某一段）特定选中并按照指数倍复制扩增，根据产生的荧光信号判读结果，但RT-PCR只能检测已知ALK融合基因类型，所以存在假阴性，也就是说对于不常见的 ALK 融合类型，RT-PCR 有可能出现漏检。RT-PCR缺点是对样本质量要求比较高，因为测的是极易降解mRNA 。
4.二代测序NGS在ALK基因检测应用越来越收到认可，NGS 检测分为 NGS-DNA测序 和 NGS-RNA测序，二代测序检测可以明确待检测基因全长的情况，而并非其中某一个片段，因此无论是待检测基因是发生点突变、融合/重排等都可以检测。大部分的检测产品是NGS-DNA测序的产品，对于ALK融合突变或跳跃突变可能会存在假阴性率较高，也就是可能存在漏检的情况。对于检出的外显子断点融合、基因间融合、罕见融合伴侣或驱动基因检测为阴性的，建议通过NGS-RNA测序验证。如果二代测序不可及、肿瘤细胞数量较少或标本质控无法满足二代测序要求时，可依据实验室平台的适用性、成本和/或组织标本量，选择qRT-PCR检测；如果检测结果为阴性或判读模糊，应使用FISH、IHC进行验证。NGS检测ALK基因的缺点费用非常贵。

虽然这四种检测方法都可以用于检测ALK融合突变，但各自也有优劣，仅就ALK基因检测来说，FISH法还是首选金标准方法；IHC法因为简单便宜可用于筛查， NGS法也可以用于ALK融合检测，且可以同时检测其他驱动基因，符合当下临床需求；RT-PCR法也可以使用，但对于一些罕见融合无法检测。
ALK阳性患者如何治疗？
目前，ALK-TKI“已经是三代同堂”的局面，ALK抑制剂极大地改变了ALK阳性NSCLC患者生存。一代ALK抑制剂克唑替尼，二代ALK抑制剂目前为色瑞替尼、阿来替尼、布加替尼和恩沙替尼，三代ALK抑制剂劳拉替尼。

克唑替尼、阿来替尼等ALK抑制剂获得性耐药的肿瘤会在ALK激酶结构域出现新的点突变。如约三分之一的克唑替尼治疗后会发生继发性点突变，特别是G1202R突变会对阿来替尼和塞瑞替尼产生耐药性，但肿瘤可能仍对劳拉替尼、布加替尼保持敏感。当复合突变存在时，缓解率较低。其他ALK抑制剂治疗后也不避免发生继发性耐药的点突变，NGS方法更推荐用于ALK-TKI 耐药的患者的基因检测，检测后需要根据检测的突变情况，针对性选择ALK 抑制剂进行治疗。

准确、快速检出ALK基因突变是NSCLC实施ALK抑制剂靶向治疗以及获益的前提。我们在考虑治疗前，需要结合病情和临床诊治需求综合考虑进行基因检测。