肺鳞的路太少，体质差可不可以节拍化疗联免疫？欢迎讨论

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   不知道为什么无法上传图片，这几日有看到很多肺鳞战友纠结化疗与免疫的问题，诚然免疫时代来临让肺鳞的路终于有点希望，但不可否认很多条件限制下我们的空间依然很窄，单免疫只有高表达情况下才比较放心大胆使用，低表达的或盲试的情况下，化疗联免疫比较稳妥，但对于体质较差的人来说，这像一场赌博，无论是免疫还是化疗，都要求战友们的有较好的身体素质，加强营养是一方面，另一方面这几天一直都有在关注低剂量节拍化疗，具体可以查社区的帖子，已经有很多战友像老马老师和鹰版给了相关资料，我不知道指南一线的化疗联免疫中是否有节拍化疗联免疫这一选项，但是如果它的确符合体质较差的患友的需要，我觉得我们可以讨论它
   下面是翻墙到外网：美国国家医学图书馆找来的低剂量化疗联免疫的小鼠研究，谷歌翻译（低剂量节拍化疗已经有许多临床，社区帖子也有，我就不在此赘述了），是这个网站，如果有条件翻墙的战友可以去那里了解更多关于癌症研究的一些临床或实验：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/       欢迎大家讨论

J免疫其他癌症。2020年；8（2）：e000807。
于2020年10月28日在线发布。doi：  10.1136 / jitc-2020-000807

PMCID：PMC7594539

PMID：33115941

原始研究前期减少剂量的化学疗法与免疫疗法协同作用，以优化鳞状细胞肺癌的化学免疫疗法[url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=He X[Author]&cauthor=true&cauthor_uid=33115941]洗染他[/url]，＃1，2 [url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Du Y[Author]&cauthor=true&cauthor_uid=33115941]羊肚[/url]，＃2，3 [url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wang Z[Author]&cauthor=true&cauthor_uid=33115941]直街王[/url]，1 [url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wang X[Author]&cauthor=true&cauthor_uid=33115941]汪鑫[/url]，1 [url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Duan J[Author]&cauthor=true&cauthor_uid=33115941]李建春段[/url]，1 [url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wan R[Author]&cauthor=true&cauthor_uid=33115941]芮湾[/url]，1 [url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Xu J[Author]&cauthor=true&cauthor_uid=33115941]甲辰许[/url]，1 [url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhang P[Author]&cauthor=true&cauthor_uid=33115941]裴咋嗯[/url]，1，2 [url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wang D[Author]&cauthor=true&cauthor_uid=33115941]王迪[/url]，1，2 [url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tian Y[Author]&cauthor=true&cauthor_uid=33115941]燕化天[/url]，4 [url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Han J[Author]&cauthor=true&cauthor_uid=33115941]Jiefei汉族[/url]，1 [url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fei K[Author]&cauthor=true&cauthor_uid=33115941]凯伦费[/url]，1 [url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bai H[Author]&cauthor=true&cauthor_uid=33115941]华白[/url]，1[url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tian J[Author]&cauthor=true&cauthor_uid=33115941]田捷[/url]，2，5和 [url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wang J[Author]&cauthor=true&cauthor_uid=33115941]杰王[/url]1file:///C:\Users\MAGICB~1\AppData\Local\Temp\ksohtml14072\wps1.png file:///C:\Users\MAGICB~1\AppData\Local\Temp\ksohtml14072\wps2.pngfile:///C:\Users\MAGICB~1\AppData\Local\Temp\ksohtml14072\wps3.png
作者信息文章注释版权和许可信息免责声明
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抽象的背景在最近的临床试验中，已经证实了将化学疗法（最大耐受剂量，MTD）与同时免疫疗法（统称为化学免疫疗法）联合用于治疗鳞状细胞肺癌（SQCLC）的生存益处。尽管如此，优化化学免疫疗法以增强SQCLC中免疫检查点抑制剂（ICIs）的功效仍有待探索。
方法为了全面研究如何增强异位淋巴样结构（ELSs）并上调抗程序性死亡1（PD-1）/的治疗靶点，使用了细胞系，同源免疫小鼠模型和患者外周血单个核细胞抗PD-1配体（PD-L1）单克隆抗体（mAb），因此使SQCLC对ICI更敏感。此外，表征了优化的分子机制。
结果低剂量化疗通过磷脂酰肌醇3-激酶/ Akt /转录因子核因子κB信号传导途径促进了抗原暴露。观察到活化的树突状细胞（DC）改善了抗原的摄取和呈递，从而激活了特异性T细胞应答，从而导致了全身性免疫应答和免疫记忆。继而，在体内观察到增强的抗肿瘤ELS和PD-1 / PD-L1表达。此外，前期节拍（低剂量和频繁给药）化学疗法延长了免疫刺激作用的时间窗，并与抗PD-1 / PD-L1 mAb有效协同。这种协同作用的潜在机制是活化的I型巨噬细胞，DC和细胞毒性CD8 +的增加T细胞以及肠道肠道菌群的维持多样性和组成。相反，当将常规MTD化疗与ICI结合使用时，效果似乎是累加的而不是协同的。
结论我们首先尝试通过研究不同的组合方式来优化SQCLC的化学免疫疗法。与当前临床实践中使用的MTD化疗相比，后续的抗PD-1 / PD-L1 mAb治疗的前期节律化疗效果更好。这种组合方法值得在其他类型的肿瘤中进行研究，然后在将来转化为临床。
关键词：药物治疗，联合治疗，免疫治疗，肺肿瘤，淋巴细胞，肿瘤浸润，转化医学研究

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介绍鳞状细胞肺癌（SQCLC）是常见的亚型，占非小细胞肺癌（NSCLC）病例的20％–30％。1在过去的几十年中，由于缺乏可靶向的突变和免疫原性低，SQCLC治疗的进展有限。SQCLC可归类为“冷”肿瘤，这意味着它对免疫疗法的敏感性较低。长期以来，常规最大耐受剂量（MTD）的铂类双线化疗已被用作一线治疗。2 3然而，在MTD上，适度的化学治疗作用和明显的全身毒性使SQCLC治疗具有挑战性。4 5
最近，免疫检查点抑制剂（ICIs），例如程序性死亡1（PD-1）及其配体PD-L1，已经彻底改变了癌症治疗方法，特别是通过与化学疗法联合使用。6 7这种组合方法被称为化学免疫疗法，与ICI单一疗法相比，已显示可显着提高反应率。8在SQCLC患者中进行的KEYNOTE-407和IMpower-131 III期试验中，观察到与化疗加安慰剂相比，pembrolizumab或atezolizumab联合MTD化疗可带来更大的临床获益，且毒性可控。9 10因此，已经提出化学免疫疗法对于SQCLC患者可能是一种极好的治疗策略。尽管如此，尽管从这些III期临床试验中获得了令人鼓舞的结果，但MTD化疗与ICI之间的实际关系仍存在争议。在过去的几十年中，大多数肿瘤学家认为MTD化疗药物会引起免疫抑制，包括骨髓减少症或淋巴细胞减少症，提示MTD化疗和免疫疗法之间可能存在拮抗作用。11-13此外，MTD化疗与并发ICI联用的毒性不容忽视，特别是对于可能耐受性较差的老年或体弱患者。应当指出，老年患者占肺癌个体的大多数，并且与年轻患者相比死亡率更高。14 15然而，在当前的标准化临床试验中，老年患者的代表性不足，主要是由于功能障碍和既往合并症。16因此，更有效的组合策略最终可以促进化学免疫疗法并减轻SQCLC患者的不良反应，仍然值得探索。
低剂量化疗药物的免疫调节作用已在肿瘤学领域引起特别关注。17-22在基因工程改造的肺腺癌小鼠模型中，Pfirschke等人观察到低剂量的奥沙利铂（OxP）与环磷酰胺联合使用可触发免疫原性应答，并与ICI组合使用可带来益处。[23]同样，Song等人证明了低剂量OxP在鼠大肠癌模型中增强了抗肿瘤异位淋巴样结构（ELSs），OxP与抗PD-L1单克隆抗体（mAb）的结合显着抑制了肿瘤的生长。24此外，小剂量和频繁（所谓的“基因组学”）给予环磷酰胺可延长免疫调节的时间范围。25 26在另一项研究中，Liu等人发现化学治疗药物和抗CD47 mAb的给药顺序和剂量显着影响免疫治疗后的宿主免疫反应。27因此，建议化疗药物的给药剂量，频率和顺序对于有效的免疫激活至关重要，尤其是与ICI联合使用时。
功能和主动的免疫系统对于持久的临床反应，尤其是对免疫疗法的反应至关重要。28岁为了通过化学免疫疗法获得最佳治疗效果，应将化学疗法视为免疫疗法的发起者或伴侣，而不是在MTD上发挥细胞毒剂的经典作用，其唯一目的是抑制肿瘤的生长。因此，对于化学免疫疗法的成功而言，找到有效的抗肿瘤免疫力与抑制毒性较小的肿瘤之间的平衡是至关重要的。在这项研究中，我们首先尝试阐明引起SQCLC低剂量化学疗法和免疫疗法协同作用的潜在分子机制，以便于设计更有效的组合化学免疫疗法。其次，为了在化疗药物诱导的免疫抑制与肿瘤免疫微环境（TIME）之间取得平衡，

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材料和方法试剂和抗体顺铂（CDDP，目录号S1166），吉西他滨（GEM，目录号S1714），多西他赛（DTX，目录号S1148），紫杉醇（PTX，目录号S1150），LY 294002（PI3Ka /δ/β抑制剂，目录号S1105），MK-2206 2HCl（Akt1 / 2/3抑制剂，目录号S1078）和BAY 11–7082（转录因子核因子κB /NF-κB抑制剂，目录号S2913）购自Selleck Chemicals（德克萨斯州休斯顿，美国）。对于体外实验，将这些试剂溶解在无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）或二甲基亚砜（DMSO； DMSO最终浓度<0.1％）中，并储存在-20°C下。对于体内研究，在给药前立即根据制造商的说明书制备化学治疗剂的溶液。胎牛血清（FBS，目录号12662029），青霉素-链霉素（目录号15140122），格拉斯哥缓冲的基本必需培养基（目录号21710082），RPMI-1640培养基（目录号61870044）和Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM，目录号11965092）购自Gibco（美国纽约大岛）。人和鼠重组干扰素-γ（IFN-γ）（Cat＃713 906和Cat＃714006），LEGENDplex重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF，Cat＃713704），重组白介素-4（IL-4），Cat＃715004）和重组高迁移率基盒-1（HMGB-1，Cat＃764004）购自Biolegend（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。脂多糖溶液（500 X）（Cat＃00-4976-93）购自eBioscience（Affymetrix，Thermo Fisher Scientific，圣地亚哥，加利福尼亚，美国）。IV型胶原酶（Cat＃C5138）和脱氧核糖核酸酶I（Cat＃D4263）购自Sigma-Aldrich Company（密苏里州圣路易斯，并用于从肿瘤组织制备单细胞悬液。用于荧光激活细胞分选（FACS）的所有荧光偶联抗体均购自BD Biosciences（英国牛津）。鼠类和人用的HMGB-1 ELISA试剂盒（Cat＃HH0016和MH0016）购自NeoScientific（美国马萨诸塞州剑桥市）。用于巨噬细胞耗竭的氯膦酸盐，中性氯膦酸盐脂质体（Cat＃F70101C-N）购自FormuMax Scientific（美国加利福尼亚州硅谷）。CD8的抗CD8αmAb（克隆169.4，目录号BE0117）用于巨噬细胞耗竭的氯膦酸盐，中性氯膦酸盐脂质体（Cat＃F70101C-N）购自FormuMax Scientific（美国加利福尼亚州硅谷）。CD8的抗CD8αmAb（克隆169.4，目录号BE0117）用于巨噬细胞耗竭的氯膦酸盐，中性氯膦酸盐脂质体（Cat＃F70101C-N）购自FormuMax Scientific（美国加利福尼亚州硅谷）。CD8的抗CD8αmAb（克隆169.4，目录号BE0117）+ T细胞耗竭，抗PD-1 mAb（CD279，克隆29F.1A12，目录号BP0273），抗PD-L1 mAb（B7-H1，克隆10F.9G2，目录号BE0101），InVivoPure pH 7.0稀释缓冲液（Cat＃IP0070）和InVivoPure pH 6.5稀释缓冲液（Cat＃IP0065）购自BioXcell（美国新罕布什尔州西黎巴嫩）。
细胞系和培养条件鼠KLN-205 SQCLC细胞系和人SQCLC细胞系SK-MES，H226和H520获自美国典型培养物保藏中心（美国马纳萨斯，美国弗吉尼亚州）。表达OVA抗原的KLN-205细胞获自COBOIER Biotechnology Co.（中国南京）。这些细胞在装有5％CO 2的潮湿培养箱中，在格拉斯哥缓冲的基本必需培养基或补充了15％FBS和1％青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中培养。在37°C下。对于体内生物发光成像（BLI），我们使用荧光素酶（Luc）基因/慢病毒转染了野生型KLN-205细胞，以按照制造商的规程建立KLN-205-Luc细胞（GeneCopoeia，Rockville，马里兰州，美国）。我们证实，KLN-205-Luc细胞的增殖，凋亡和分化与野生型KLN-205细胞相当。为了建立小鼠未成熟的骨髓来源的树突状细胞（BMDC），我们从DBA-2J小鼠的股骨和胫骨中提取了骨髓，并将其与裂解液一起孵育4分钟以裂解红细胞（RBC）。用细胞培养基冲洗后，播种4×10 5将细胞每孔放入6孔板中，并在2 mL含10％FBS，20 ng / mL GM-CSF和10 ng / mL IL-4的DMEM中培养。每两天用新鲜培养基替换50％的培养基。5天后，我们收获了非粘附和松散粘附的细胞，并将其用于BMDC实验。
SQCLC同基因小鼠模型和体内BLI的建立DBA-2J雄性小鼠（7–8周大，21–23 g）购自北京HFK生物科学有限公司（中国北京）。我们通过皮下注射将5×10 5 KLN 205-Luc细胞植入小鼠的右侧腹。当可触知肿瘤时，将小鼠随机分为不同的治疗组。BLI用于动态监测体内肿瘤的生长。用3％异氟烷麻醉小鼠，然后腹膜内注射D-荧光素（120 mg / kg，100μL）。4分钟后，我们使用了Caliper IVIS Lumina III实时成像系统来评估Luc的发光。治疗后，收集肿瘤和脾脏作进一步评估。
荧光激活细胞分选收获经过药物处理或与条件培养基孵育后生长的细胞，并用预冷的PBS冲洗一次。随后将细胞在室温（RT）下用抗CD16 / CD32抗体染色30分钟以封闭Fc受体，然后在4°C下用适当的荧光素异硫氰酸酯偶联抗体标记30分钟，然后洗涤一次用PBS。为了制备用于FACS的单细胞肿瘤组织悬液，将肿瘤在无FBS的RPMI-1640培养基中消化，该培养基含有1 mg / mL IV型胶原酶和1μg/ mL脱氧核糖核酸酶I，在90°C下消化90分钟，然后通过100μm细胞过滤器（美国纽约州康宁的康宁公司）。为了制备单细胞脾脏组织悬液，用镊子将脾脏压碎，通过细胞滤网过滤，并与RBC裂解缓冲液在室温下孵育5分钟。将KLN 205-Luc细胞冷冻并解冻3次，并将所得细胞碎片用于刺激单细胞脾悬液过夜。后续步骤与针对细胞系所述的步骤相同。我们用FACScan细胞仪（Becton Dickinson）分析了细胞，每个样品获得了10,000或100,000个细胞。
酶联免疫吸附为了评估分泌到培养基中的HMGB-1，我们处理了细胞（如上所述）并收集了条件培养基（上清液）。在3500 rpm下离心5分钟后，我们按照试剂盒制造商的说明，通过ELISA评估了条件培养基中的HMGB-1。
统计分析定量数据代表平均值±SD。使用SPSS软件（V.16.0）分析数据，并使用GraphPad Prism V.5.0（美国加利福尼亚州拉荷亚）创建图形。使用学生t检验或Mann-Whitney U检验评估统计学显着性，其中p <0.05被认为具有统计学显着性（无显着性； * p <0.05； ** p <0.01； *** p <0.001）。

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结果低剂量化疗通过SQCLC中的磷脂酰肌醇3-激酶/ Akt /NF-κB信号传导途径诱导免疫原性细胞死亡免疫原性细胞死亡（ICD）激活宿主免疫系统并增强抗肿瘤免疫反应。在ICD期间，癌细胞抗原（包括新抗原）可能会被释放并被识别，从而引发更大的免疫反应。29种主要的ICD标记包括主要的组织相容性复合物（MHC）-I类，人白细胞抗原（HLA）-A / B / C和HMGB-1。使用Cell Counting Kit-8评估了化学治疗药物在不同SQCLC细胞系中的细胞毒性作用，并使用SPSS V.16.0软件计算了25％和50％的最大抑制浓度（IC 25和IC 50）并使用在随后的实验中（在线补充图S1）。如图在线补充图S2所示，低剂量化疗药物（CDDP，GEM，DTX，PTX）以剂量依赖性和时间依赖性方式上调ICD标记和PD-L1表达，从而表明（新）抗原暴露增加和SQCLC免疫原性增强。然后进行高通量RNA测序，以鉴定可能参与ICD诱导的信号通路（图1A，总景观）。数据显示，在低剂量化疗药物（4μMCDDP，20μMGEM，1μMPTX，1μMDTX）处理24小时后，KLN-205细胞中有178个免疫相关基因显着差异表达（图1B 在线补充表S1）中显示了178个基因。有趣的是，我们观察到了治疗后磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/ Akt和NF-κB（在线补充表S1）的差异表达。NF-κB是TIME内固有免疫和适应性免疫的关键调节剂。30–32因此，我们进一步研究了PI3K / Akt /NF-κB信号通路是否也参与了低剂量化学疗法诱导的免疫调节作用。与该假设一致，FACS数据分析的结果表明，CDDP诱导或GEM诱导的PD-L1，MHC I类，HLA-A / B / C和细胞质HMGB-1表达的增加在经预处理或经处理的细胞中被废止与BAY 11–7082（NF-κB抑制剂），LY294002（PI3K抑制剂）或MK2206（Akt抑制剂）共同孵育，尽管程度不同（图1C–N）。这些观察结果表明，低剂量化疗药物可能通过PI3K / Akt /NF-κB信号传导途径诱导了ICD，刺激了免疫原性低的SQCLC癌细胞释放更多的新抗原和HMGB-1，进而增强了抗肿瘤免疫反应。。

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图1
低剂量化疗可能通过SQCLC细胞系中的PI3K / Akt /NF-κB信号传导途径诱导ICD。（A和B）RNA测序分析，评估低剂量化疗（CDDP 4 μM，GEM 20 μM，PTX 1 μM，DTX 1 μM）处理24小时后免疫相关基因的表达。（C–F）与指定的化学治疗剂或对照（阴性和阳性）孵育24小时（有或没有用1-3 μM BAY预处理）后，FACS显示的表达细胞表面PD-L1的SQCLC细胞百分比–7082（BAY），一种NF-κB抑制剂，持续30 min–3小时。（G–I）与指定的化疗药物或阴性对照孵育24小时（有或没有）后，通过FACS通过FACS表达（G）H226，（H）H520和（I）SK-MES细胞表达细胞质HMGB-1的百分比同时使用0.2 μM BAY进行治疗。（J–L）（J）KLN-205，（K）H226，（L）与指定的化疗药物或对照温育24小时后，通过FACS表达SK-MES细胞的细胞表面PD-L1，无论是否同时用10 μM LY294002，PI3K抑制剂或10 μM MK-2206处理，一种Akt抑制剂。（M）表达细胞表面MHC-Class I的KLN-205细胞的百分比。（N）与指定的化学治疗剂或对照孵育24小时后，用或孵育表达细胞表面HLA-A / B / C的H226细胞的百分比。无需同时使用10 μM LY294002或10 μM MK-2206进行处理。数据表示为平均值±SD；与单独的化学疗法相比，化学疗法+抑制剂的* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001。CDDP，顺铂；DTX，多西他赛; FACS，荧光激活细胞分选；创业板，吉西他滨；HLA，人类白细胞抗原；HMGB-1，高移动性分组框1；ICD，免疫原性细胞死亡；干扰素，干扰素；MHC，主要组织相容性复合体；NF-κB，转录因子核因子κB；PD-L1，编程的死亡配体1；PI3K，磷脂酰肌醇3-激酶；PTX，紫杉醇；SQCLC，鳞状细胞癌。
补充资料jitc-2020-000807supp001.pdf
补充资料jitc-2020-000807supp002.xls
SQCLC细胞低剂量化疗诱导的HMGB-1分泌促进树突状细胞的成熟树突状细胞（DC）负责抗原呈递，并在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。33损伤相关分子模式（DAMP）是ICD细胞释放的内源性危险信号。DAMP加剧了抗肿瘤免疫反应。考虑到HMGB-1是最能说明和最重要的DAMPs之一，[ 34]我们评估了低剂量化疗药物是否通过HMGB-1影响了鼠BMDC的成熟。我们用低剂量化疗剂孵育KLN-205细胞30小时，然后透析条件培养基以去除残留的化疗剂。然后将未成熟的BMDC与透析过的培养基再孵育24小时。结果，我们观察到三种成熟的BMDC亚型，包括CD11c的比例增加+ CD11b + CD80 +细胞，CD11c + CD11b + CD86 +细胞和CD11c + CD11b + MHC II类+细胞（图2A和在线补充数据S3），以及成熟的BMDC总数（图2B）。数据表明，用低剂量化疗药物治疗的癌细胞分泌的分子可以诱导DC成熟。考虑到DAMP HMGB-1在TIME内所起的关键作用，我们接下来通过ELISA评估了相同条件培养基中的HMGB-1水平。与阴性对照培养基相比，我们观察到用低剂量的四种化疗药物中的任何一种处理的KLN-205细胞在条件培养基中的HMGB-1水平显着增加（图2C）。此外，在用50 ng / mL或100 ng / mL重组HMGB-1刺激未成熟的BMDC 24小时后，共表达上述标志物的BMDC的百分比也呈剂量依赖性增加（图2D）。这些数据表明，低剂量的CDDP，GEM，DTX和PTX可以通过诱导HMGB-1从SQCLC细胞释放来增强DC成熟。

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图2
低剂量化学疗法诱导SQCLC细胞释放HMGB-1，从而促进DC成熟（AD）并诱导全身免疫应答以及体内免疫记忆（E，F）。将KLN 205-Luc细胞与4 μM CDDP，20 μM GEM，1 μM DTX或1 μM PTX孵育30小时，然后使用10,000-MWCO透析管将条件培养基于4°C透析24小时。清除任何残留的化疗药物。然后在6孔板（1×10 6个细胞/ mL）中培养的未成熟鼠源性树突状细胞（BMDC）在无条件培养基（阴性对照），含LPS的培养基（10 μg / mL，阳性对照）中培养，或其他条件培养基，并在24小时后收获。通过测量CD11c的细胞表面共表达来评估BMDC的成熟状态通过FACS + CD11b + CD80 +，CD11c + CD11b + CD86 +和CD11c + CD11b + MHC II类+ （A）如通过FACS所揭示的，在不同的刺激之后表达三种不同细胞成熟生物标志物的上述组合的BMDC的百分比。（B）在不同刺激之后，每组中成熟BMDC总数的比例。（C）通过ELISA评估，用不同的化学治疗剂处理30小时后培养基中的HMGB-1水平。（D）用50 ng / mL或100 ng / mL重组HMGB-1刺激未成熟的BMDC 24小时，并对CD11c + CD11b +进行FACS分析进行了CD80 +，CD11c + CD11b + CD86 +，CD11c + CD11b + MHC II类+表达。（E，F）将鼠KLN-205-Luc细胞用1μMCDDP，15μMCDDP预处理72小时，或用PBS作为阴性对照。将这些预处理的细胞（1×10 6）皮下注射到小鼠的右胁腹中。7天后收获脾细胞，并根据试剂盒制造商的方案使用ELISPOT评估IFN-γ的分泌。（G）前述小鼠用2×10 5攻击。对侧的KLN-205细胞存活，并使用游标卡尺和BLI监测肿瘤的生长。数据表示为平均值±SD。无显着性，* p <0.05；** p <0.01；*** p ＜0.001。BLI，生物发光成像；CDDP，顺铂；DC，树突状细胞；DTX，多西他赛; ELISPOT，酶联免疫斑点；FACS，荧光激活细胞分选；创业板，吉西他滨；HMGB-1，高移动性分组框1；IFN-γ，干扰素-γ；LPS，脂多糖；吕克，萤光素酶；MHC，主要组织相容性复合体；PBS，磷酸盐缓冲盐水；PTX，紫杉醇。
低剂量化疗诱导全身性抗肿瘤免疫反应和免疫记忆接下来，使用同基因的具有免疫能力的SQCLC小鼠模型评估低剂量化学疗法在体内是否具有免疫激活作用。我们用1μMCDDP，15μMCDDP或等体积的媒介物（PBS，阴性对照）预处理KLN-205-Luc细胞72小时。然后将预处理的细胞注射到小鼠的右侧腹中。7天后，收获脾细胞用于酶联免疫斑点（ELISPOT）测定，以评估IFN-γ的分泌。与阴性对照和高剂量CDDP相比，经低剂量CDDP预处理的KLN-205细胞注射的小鼠脾细胞分泌更多的IFN-γ（图2E，F），表明全身性抗肿瘤免疫反应增强。在第7天，我们用未处理的KLN-205-Luc细胞在相反的侧面攻击小鼠，并通过BLI动态监测肿瘤的生长，以评估CDDP预处理产生的免疫记忆。与对照组小鼠（七只小鼠中的七只）和高剂量CDDP组小鼠（七只小鼠中的七只）相比，用低剂量CDDP预处理的肿瘤细胞注射的小鼠表现出更少的肿瘤负荷（七只小鼠中的一只）。）（图2G）。这些数据表明，低剂量CDDP预处理具有更高的免疫原性，可以保护小鼠免于肿瘤复发。因此，低剂量CDDP治疗可以激活体内的全身免疫反应和免疫记忆。
低剂量单药治疗药物在体内引起活跃的SQCLC TIME诸如增加PD-1 / PD-L1表达和增强ELS（包括CD8 +细胞毒性T细胞，I型肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和DC）等策略对于使TIME对ICI更敏感至关重要。因此，我们探索了化学治疗剂的不同剂量和给药时间策略，以在具有SQCLC肿瘤的同基因免疫功能DBA-2J小鼠中诱导活性抗肿瘤免疫，从而提供ICI反应支持性TIME。目前，MTD结合ICI联合铂类双线化疗是晚期SQCLC患者的一线治疗。为了优化这种组合，为小鼠研究设计了药物给药时间表，并在在线补充图S4A中显示。在MTD时CDDP（5 mg / kg，Q7D，4个周期）加上GEM（160 mg / kg，Q4D，4个周期）显着抑制肿瘤生长（在线补充图S4B），但也导致II型数量显着增加通过FACS（在线补充图S4C，D）和免疫组织化学分析（在线补充图S4E）检测到的TAM，表明免疫抑制时间与随后或同时进行的免疫治疗不兼容。接下来，根据国家综合癌症网络指南的推荐剂量和人-鼠剂量转换公式，12 35我们推导了适用于小鼠的MTD剂量。然后，我们查阅了以前发表的数据，以进一步定义小鼠是否可以承受这些剂量。之后，我们在小鼠中测试了剂量，以确认腹膜内给药后平均体重减轻不到初始体重的10％。如在线补充表S2所示，低剂量约为高剂量的三分之一。接下来，我们尝试比较低剂量CDDP 2.8 mg / kg，高剂量CDDP 8.4 mg / kg，低剂量GEM 60 mg / kg，高剂量GEM 240 mg / kg，低剂量后TIME的具体差异。 -剂量PTX 11毫克/千克，高剂量PTX 33毫克/千克，低剂量DTX 11毫克/千克，高剂量DTX 33毫克/千克施用或赋形剂。如图所示图3A，B和在线补充图S5，我们观察到小剂量CDDP，GEM，PTX，DTX促进了30小时后肿瘤内CD45 + CD3 +和CD45 + CD3 + CD8 +细胞浸润（细胞毒性T细胞）的增强，尤其是PTX和DTX 。相反，大剂量治疗促进了肿瘤内CD45 + CD3 + CD4 + CD25 +调节性T细胞（Treg）浸润，表明肿瘤微环境中免疫抑制作用增强。另外，如图所示图3C，D，未接受过SQCLC治疗的患者接受MTD白蛋白-PTX（第0天）+尼伏鲁单抗（常规给药）或低剂量白蛋白-PTX（第0天和第7天为1/2 MTD）+尼沃鲁单抗（常规给药）。按照标准程序[ 36]通过密度梯度离心从患者血液中分离出外周血单个核细胞（PBMC）并进行了FACS分析。在治疗前（第0天），对基线PBMC进行了评估。在第7天（第二次低剂量白蛋白-PTX给药之前），再次检测到PBMC。我们观察到小剂量白蛋白-PTX +尼古鲁单抗治疗后细胞毒性T细胞上调，这与从动物模型获得的数据一致。此后，我们评估了低剂量化学疗法引起强大的ELS激活反应并增强后续免疫疗法的潜力。一次小剂量注射后二十四小时，CDDP（2.8 mg / kg），GEM（80 mg / kg），DTX（11 mg / kg）或PTX（11 mg / kg）单一疗法在体内具有独特的免疫调节作用，提高CD45 + PD-1 +细胞，CD11c + CD83 +细胞的百分比细胞（激活的DC），CD11c + MHC II类+细胞（激活的DC），CD11b + F4 / 80 + CD11c +细胞（I型TAM），CD3 + CD8 + T细胞和CD3 + CD4 + T细胞肿瘤和脾脏组织（图4）。以上数据提供了前期小剂量单药治疗药物联合后续免疫疗法治疗SQCLC的潜力的证据。此外，我们的数据表明，前期小剂量单药化疗后24小时可能是开始免疫治疗的好时机。

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图3
与体内低剂量方案相比，高剂量SQCLC单化学疗法可诱导更大的免疫抑制作用。（A）化疗方案。如上所述建立同系小鼠模型。当肿瘤明显时，将小鼠随机分为九组，分别接受腹膜内注射低剂量CDDP 2.8 mg / kg，高剂量CDDP 8.4 mg / kg，低剂量GEM 60 mg / kg，高剂量GEM 240 mg / kg，低剂量PTX 11毫克/千克，高剂量PTX 33毫克/千克，低剂量DTX 11毫克/千克，高剂量DTX 33毫克/千克或赋形剂。（B）30小时后，收获肿瘤用于FACS分析。（C，D）初治的SQCLC患者接受MTD白蛋白-PTX（第0天）+尼伏鲁单抗（常规给药）或低剂量白蛋白-PTX（第0天和第7天为1/2 MTD）+尼伏鲁单抗（常规管理）。在治疗前（第0天），通过FACS评估基线PBMC。在第7天（在第二次低剂量白蛋白-PTX之前），再次通过FACS评估PBMC。然后比较治疗前后的细胞分数（细胞毒性T细胞和Treg细胞）。数据表示为平均值±SD。NS，无显着性，* p <0.05；** p <0.01；*** p ＜0.001。CDDP，顺铂；DTX，多西他赛; FACS，荧光激活细胞分选；创业板，吉西他滨；吕克，萤光素酶；MTD，最大耐受剂量；PBMC，外周血单个核细胞；PTX，紫杉醇；SQCLC，鳞状细胞肺癌；Treg，调节性T细胞。荧光激活细胞分选；创业板，吉西他滨；吕克，萤光素酶；MTD，最大耐受剂量；PBMC，外周血单个核细胞；PTX，紫杉醇；SQCLC，鳞状细胞肺癌；Treg，调节性T细胞。荧光激活细胞分选；创业板，吉西他滨；吕克，萤光素酶；MTD，最大耐受剂量；PBMC，外周血单个核细胞；PTX，紫杉醇；SQCLC，鳞状细胞肺癌；Treg，调节性T细胞。

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图4
小剂量SQCLC单化学疗法在体内引起活跃的TIME。（A）化疗方案。如前所述建立同系小鼠模型。当可触知肿瘤时，将小鼠随机分为五组，然后腹膜内注射CDDP 2.8 mg / kg，GEM 80 mg / kg，DTX 11 mg / kg，PTX 11 mg / kg或赋形剂。（B）24小时后，收集肿瘤和脾组织用于FACS分析。数据表示为平均值±SD。NS，无显着性，* p <0.05；** p <0.01；***与阴性对照相比，p ＜0.001。CDDP，顺铂；DTX，多西他赛; FACS，荧光激活细胞分选；创业板，吉西他滨；吕克，萤光素酶；PTX，紫杉醇；SQCLC，鳞状细胞肺癌；时间，肿瘤免疫微环境。
补充资料jitc-2020-000807supp003.pdf
当与抗PD-1 mAb在体内联合使用时，顺序低剂量CDDP比MTD CDDP发挥更明显的协同抗肿瘤作用由于上述低剂量单一疗法在体内引起强烈的抗肿瘤免疫反应并诱导更大的PD-1 / PD-L1表达，因此设计了以下治疗方案，如图5A。我们观察到，与MTD CDDP加抗PD-1 mAb相比，前期低剂量CDDP和抗PD-1 ICI的顺序给药导致更明显的协同抗肿瘤反应（图5B–D和F）。此外，在这种药物组合后观察到的体重减轻较小（图5E），并且治疗并未显着升高血清丙氨酸转氨酶或天冬氨酸转氨酶，也没有对全血中的RBC，血红蛋白和血小板产生负面影响（图5M–Q）。如图所示图5G–L和在线补充图S6，经过CDDP /抗PD-1 mAb组合化学免疫疗法的三个治疗周期后，我们观察到CD45 + CD3 +细胞（淋巴细胞），CD45 + CD3 + CD8 +细胞（细胞毒性T细胞），CD45数量增加+ CD3 + CD8 + PD-1 +细胞（以抗PD-1 / PD-L1 mAb为靶标），CD11c + CD83 +细胞和CD11c + CD86 + （激活的DC），与接受MTD CDDP联合抗PD-1 mAb的小鼠相比，表明抗肿瘤免疫应答增强，治疗靶标表达上调。

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图5
结合抗PD-1 mAb，顺序低剂量CDDP发挥的协同抗肿瘤作用比MTD CDDP更大。（一）治疗方案。前期低剂量CDDP（2.8 mg / kg，Q7D），MTD CDDP（8.4 mg / kg，Q14D），低剂量或MTD CDDP结合抗PD-1 mAb，单独抗PD-1 mAb和载体对照通过腹膜内注射（IP）。（B）治疗期间的肿瘤生长曲线。（C，D）治疗后的肿瘤重量和标本。（E）治疗期间体重变化。（F）通过BLI监测的肿瘤生长。（GL）单细胞肿瘤悬液用于FACS，以评估肿瘤内CD45 + CD3 +细胞，CD45 + CD3 + CD8 +细胞，CD45 + CD3 + CD8 +PD-1 +细胞，CD11c + CD83 +细胞和CD11c + CD86 +细胞。（M–Q）治疗后全血中血清，红细胞，HGB和PLT中的ALT和AST。数据表示为平均值±SD。NS，无显着性，* p <0.05；** p <0.01；*** p ＜0.001。ALT，丙氨酸转氨酶；AST，天冬氨酸转氨酶；BLI，生物发光成像；CDDP，顺铂；FACS，荧光激活细胞分选；HGB，血红蛋白；mAb，单克隆抗体；MTD，最大耐受剂量；PD-1，程序性死亡1；PLT，血小板；红细胞，红细胞。
与MTD方案结合抗PD-1 mAb组合使用相比，前期节律性DTX加抗PD-1 mAb抑制SQCLC的生长更有效目前，MTD化疗联合ICIs是SQCLC患者的标准治疗方法。因此，我们探讨了在同时使用抗PD-1 mAb治疗时，节律性（小剂量和频繁给药）化疗是否会优于常规的MTD方案。考虑到低剂量DTX在体内引起的抗肿瘤免疫反应比其他测试药物要强（图3和4），我们选择了DTX进行进一步研究。我们使用的治疗时间表如下所示图6A。使用上面提到的人-鼠剂量转换公式，每只小鼠的DTX剂量为33 mg / kg，相当于成人DTX的常规标准剂量（即MTD）。在这六个治疗组中，连续施用节律性DTX继之以抗PD-1 mAb表现出最佳的治疗效果（图6C–F）。此外，与MTD DTX相比，当两者均与ICI结合使用时，节律性DTX可以降低体重减轻（图6B）。我们进一步消化了肿瘤以创建单细胞悬液，并通过FACS分析评估了免疫相关标记。肿瘤内TAMs图6G），输入I TAM（图6H）和激活的DC（图6J–L在用节律性DTX加抗PD-1 mAb治疗的小鼠中，所有d均显着升高。在肿瘤中观察到II型巨噬细胞水平升高（图6I）用MTD DTX处理的小鼠），提示存在明显的免疫抑制作用。另外，为了评估肿瘤抗原特异性T细胞反应，对携带已确立表达OVA的KLN205肿瘤的小鼠进行小剂量DTX +抗PD-1 mAb，大剂量DTX +抗PD-1 mAb或如上所述通过腹膜内注射控制媒介物。治疗3周后，将引流肿瘤的同侧淋巴结制成单细胞悬液，并进行ELISPOT分析以检测IFN-γ分泌。如图所示图6M，N与其他两组相比，低剂量DTX +抗PD-1 mAb治疗后观察到的斑点数量明显更高。上述数据表明，与MTD DTX加抗PD-1 mAb相比，与抗PD-1 mAb结合时，节律性DTX在触发免疫激活方面更有效，并且其抗肿瘤作用更大程度地增强。

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图6
结合抗PD-1 mAb，前期节拍型DTX比常规MTD DTX发挥更大的肿瘤抑制作用。（一）治疗方案。前期低剂量节拍型DTX（10 mg / kg，Q4D），常规MTD DTX（33 mg / kg，Q7D），等同于患者的标准剂量，低剂量或MTD DTX结合抗PD-1在小鼠中腹膜内（IP）注射mAb，单独的抗PD-1 mAb或媒介物对照。（B）治疗期间体重变化。（C）治疗期间的肿瘤生长曲线。（D，E）治疗后的肿瘤标本和重量。（F）通过BLI监测的肿瘤生长。（GL）治疗后，将单细胞肿瘤悬液用于FACS。（G）CD11b + F4 / 80 +细胞（TAM）。（H）CD11b + F4 / 80 +MHC-II +细胞（I型TAM）。（I）CD11b + F4 / 80 + CD206 +细胞（II型TAM）。（J）CD11c + CD83 +细胞（激活的DC）。（K）CD11c + CD86 +细胞（激活的DC）。（L）CD11c + MHC-II +单元（激活的DC）。（M，N）用小剂量+抗PD-1mAb，大剂量DTX +抗PD-1mAb或通过IP注射的媒介物对照治疗携带已确立的表达OVA的KLN-205肿瘤的小鼠。治疗3周后，将引流肿瘤的同侧淋巴结制成单细胞悬液，并进行ELISPOT分析。数据表示为平均值±SD。NS，无显着性，* p <0.05；** p <0.01；*** p ＜0.001。BLI，生物发光成像；DC，树突状细胞；DTX，多西他赛; ELISPOT，酶联免疫斑点；FACS，荧光激活细胞分选；吕克，萤光素酶；mAb，单克隆抗体；MHC，主要组织相容性复合体；MTD，最大耐受剂量；PD-1，程序性死亡1；TAM，I型肿瘤相关巨噬细胞。
巨噬细胞，CD8 + T细胞和肠道菌群参与节律性DTX和抗PD-1 mAb的协同抗肿瘤作用为了进一步阐明潜在的体内前节律性DTX和抗PD-1 mAb协同作用的潜在机制，在化学免疫疗法之前进行了巨噬细胞和CD8 + T细胞的消耗。详细的给药时间表在图7A。如图所示图7B，C耗竭预处理显着改变了节律性DTX结合抗PD-1 mAb的肿瘤生长延迟，这表明巨噬细胞和CD8 + T细胞可能在介导协同抗肿瘤作用中起关键作用。此外，我们研究了抗PD-1 mAb和抗PD-L1 mAb治疗在与节拍型DTX结合使用时是否会导致不同的结果。如图所示图7B–E，两种组合疗法均具有抗肿瘤活性，两者之间的差异不显着（p> 0.05）。然后，我们在治疗结束时收集小鼠粪便，并进行了下一代RNA测序（16S rRNA高变区）。在MTD DTX加抗PD-1 mAb后观察到的肠道肠道菌群多样性的减少似乎更大（图7F，p = 0.11）与节律性DTX与抗PD-1 mAb组合后的相比较。但是，差异并不显着。此外，通过主成分分析，我们在MTD DTX和抗PD-1 mAb组合组的样品中观察到了异常的微生物组成（图7G）。以上数据表明，肠道菌群也可能参与了观察到的协同抗肿瘤作用。

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图7
巨噬细胞，CD8 + T细胞和肠道菌群可能有助于DTX加抗PD-1 mAb的协同抗肿瘤作用。（A）给药时间表示意图。巨噬细胞耗竭（clodronate，中性clodronate脂质体，每只小鼠100 μL，Q3D，腹膜内（IP））和CD8 +在实验开始前5天进行T细胞耗竭（体内抗CD8αmAb）治疗。治疗组包括DTX（10 mg / kg，Q3D，IP）结合抗PD-1 mAb（10 mg / kg，Q3D，IP），DTX（10 mg / kg，Q3D，IP）与抗PD结合-L1 mAb（10 mg / kg，Q3D，IP）或阴性对照（车辆，Q3D，IP）。（B）通过BLI监测的肿瘤生长。（C）在治疗后从SQCLC模型解剖的肿瘤。（D）在治疗期间的肿瘤生长曲线，使用游标卡尺监测。（E）治疗后的肿瘤重量。（F）治疗后肠内肠道菌群的多样性。（G）处理后的微生物组成。数据表示为平均值±SD。NS，无显着性，* p <0.05；** p <0.01；*** p ＜0.001。BLI，生物发光成像；DTX，多西他赛; 吕克，萤光素酶；mAb，单克隆抗体；PD-1，程序性死亡1；PD-L1，编程的死亡配体1；SQCLC，鳞状细胞癌。

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讨论迄今为止，尚无关于优化SQCLC化学免疫疗法策略的研究。在这项工作中，我们主要集中于探索如何将“冷”的SQCLC转变为ICI敏感的肿瘤，从而通过改善化学疗法和ICI之间的协同作用来增强化学免疫疗法的疗效。此外，我们旨在确定体外和体内可能的潜在功能机制。这是第一项证明前期节律性化学疗法可与免疫疗法协同作用，以在SQCLC中获得明显更好的治疗效果的研究。这主要是通过CD8 + T细胞和DC的募集和激活，I型巨噬细胞的极化以及肠道肠道菌群多样性和正常组成的维持来实现的。
达到免疫激活和肿瘤抑制之间的平衡对于优化化学免疫疗法非常重要。在本文中，我们探索了在同系SQCLC小鼠模型中化学疗法可引发强大的抗肿瘤免疫应答的方法。在低剂量下，所有测试的化学治疗剂在脾脏和肿瘤组织中均具有强大的体内ELS调节作用。为了使化学疗法诱导最佳的TIME，药物的给药顺序至关重要。但是，很少有信息可用于预测联合治疗的功效和相关效果。我们发现免疫治疗前24小时进行小剂量化疗可能是化学免疫治疗的好方法，
我们进一步比较了常规MTD和低剂量DTX方案的免疫刺激作用之间的差异。数据显示低剂量DTX可以显着激活TIME，并诱导抗PD-1 / PD-L1 mAb治疗靶标更高的表达。相反，常规MTD DTX可以观察到免疫抑制作用。当与抗PD-1 mAb依次结合使用时，与MTD DTX相比，小剂量的节拍型DTX更有效且毒性更小。关于不同DTX方案的疗效和耐受性，以前的出版物报道，与MTD DTX（75 mg / m）相比，低剂量和致密DTX（33.3 mg / m 2，每周）导致NSCLC患者的淋巴细胞减少明显降低2，每3周一次），37荟萃分析报告了相似的结果。38综上所述，这些结果表明，与常规的MTD化疗相比，节律性化疗可能更适合后续免疫治疗。
基于上述数据，我们建议低剂量节拍型DTX和抗PD-1 mAb的顺序组合可能是SQCLC患者的有希望的治疗选择。考虑到人与小鼠模型之间的差异，我们评估了STDCL患者在MTD白蛋白-PTX（第0天）+ nivolumab（常规给药）或小剂量白蛋白-PTX（第0天为1/2 MTD）之前和之后获得的PBMC。和第7天）+ nivolumab（常规给药）。数据显示低剂量白蛋白-PTX + nivolumab治疗后细胞毒性T细胞上调，而MTD白蛋白-PTX + nivolumab导致更严重的免疫抑制（Treg细胞浸润增加），这与从动物模型获得的数据一致。另一方面，鉴于将pembrolizumab与同时进行的MTD化疗（卡铂加PTX或nab-PTX）联合用于SQCLC患者的生存获益，我们得出结论，目前用于癌症患者的化疗剂量是有效的，但不是最佳的。另外，应注意，通常需要较长的无化疗休息时间，以避免MTD化疗期间的全身毒性。在这种情况下，即使可以在一定程度上激活TIME，也无法实现连续刺激，并且在无药期间可能会发生逆转。此外，在最新的多队列2期临床试验之一中，Voorwerk 应当指出的是，通常需要较长的无化疗休息时间，以避免MTD化疗期间的全身毒性。在这种情况下，即使可以在一定程度上激活TIME，也无法实现连续刺激，并且在无药期间可能会发生逆转。此外，在最新的多队列2期临床试验之一中，Voorwerk 应当指出，通常需要较长的无化疗休息时间，以避免MTD化疗期间的全身毒性。在这种情况下，即使可以在一定程度上激活TIME，也无法实现连续刺激，并且在无药期间可能会发生逆转。此外，在最新的多队列2期临床试验之一中，Voorwerk等人证明，在转移性三阴性乳腺癌患者中，进行2周低剂量化疗诱导后再用nivolumab有助于提高客观缓解率。39
关于前期节拍型DTX和抗PD-1 mAb之间的潜在协同机制，我们观察到巨噬细胞，CD8 + T细胞和肠道菌群可能参与其中。据报道，肠道菌群是免疫力和骨髓造血功能的关键协调器，并参与对化学疗法和免疫疗法的治疗反应。40 41例如，在小鼠中的研究表明，当通过广谱抗生素治疗耗尽肠道指标时，铂化合物的抗肿瘤作用会大大削弱。42在抗生素治疗的小鼠中，抗CTLA-4 mAb和抗PD-L1 mAb治疗的抗肿瘤作用也有类似的下降。43 44在这项研究中，与节律性DTX加抗PD-1 mAb治疗相比，MTD DTX联合抗PD-1 mAb治疗后，异常微生物组成和肠道菌群多样性降低更为严重，这表明前者可能会干扰肠道菌群的内在平衡，降低肿瘤抑制作用。肠道菌群可能影响治疗效果的潜在机制需要进一步探索。最后但并非最不重要的是，许多因素可能会影响化学免疫疗法的功效。药物剂量，给药顺序和给药频率，以及开始化疗和免疫治疗之间的时间间隔都可能影响临床获益。

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结论在对SQCLC细胞系，同源小鼠模型和患者样品进行逐步研究后，我们得出结论，与常规MTD化疗相比，低剂量化疗有助于重塑更活跃的SQCLC免疫微环境。与MTD的化疗相比，随后的抗PD-1 / PD-L1 mAb治疗的前期节律化疗效果更好。相比之下，MTD化疗与ICI联合使用时似乎比协同作用更具加和作用。因此，这项临床前研究为优化SQCLC患者的化学免疫疗法的新策略提供了证据。值得进一步探讨，然后在将来将此方法转化为临床。
补充资料jitc-2020-000807supp004.pdf

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脚注XH和YD贡献均等。
贡献者： JW，JT和HB设计了整个项目并修改了手稿。XH和YD进行了实验，获取并分析了数据，并撰写了手稿。JW，XW，JD，RW，JX，PZ，DW，YT，JH和KF提供了技术或物质支持，并帮助收集了患者的标本。
资助：本研究已获得中国科学技术部的资助（No. 2017YFA0205）；教育部创新团队发展项目（IRT-17R10号）；国家自然科学基金（No. 81871514，81227901，81470083，91859119）; 国家自然科学基金重点项目（第81630071号）；国家重点研究发展项目（No. 2019YFC1315700）; CAMS医学创新基金（No. CIFMS 2016-I2M-3-008）; CAMS肺癌转化研究重点实验室（No. 2018PT31035）; 爱友基金会（编号KY201701）。
竞争利益：未宣布任何利益。
病人同意发表：不需要。
伦理批准：涉及DBA-2J小鼠的所有程序均符合机构动物护理和使用委员会（许可证编号2017-0042）的规定。关于患者的治疗和外周血采集，所有研究参与者均已获得知情同意，并且研究设计得到了美国国家癌症/癌症医院临床研究中心的适当伦理审查委员会的批准（许可号NCC2018-074）。
出处和同行评审：未委托；外部同行评审。
数据可用性声明：与研究相关的所有数据均包含在文章中或作为补充信息上载。涉及该研究的所有数据均可在已发表的文章和补充信息中找到。
补充材料该内容由作者提供。尚未由BMJ Publishing Group Limited（BMJ）审核，并且可能未经过同行评审。所讨论的任何观点或建议仅是作者的观点或建议，而未经BMJ认可。BMJ不承担由于对内容的任何依赖而产生的所有责任。如果内容包括任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性（包括但不限于当地法规，临床指南，术语，药物名称和药物剂量），并且对于任何错误和/或错误不承担任何责任由于翻译和改编或其他原因而导致的遗漏。