基因上加一点，做温暖的科技

基因上加一点，做温暖的科技

什么叫基因呢?基因，生命的基本要素，伴随着人的一生。在与癌症斗争过程中，科学家逐渐认识到肿瘤是一种基因（组）病，肿瘤的发生发展会经历一个长期的多基因突变的分阶段的过程，肿瘤治疗过程中表现的不同临床特点，都跟基因有密切关系。高通量测序技术及生物信息学的发展，使得全面精准检测患者的基因突变信息成为可能，通过从基因层面探查肿瘤形成的起因，为肿瘤临床治疗提供更多的依据。

但是，关于基因检测有着太多不了解：基因检测具体是什么？肿瘤异质性是什么？ctDNA检测是什么？组织检测是什么？检测结果都是EGFR突变，为何靶向用药的效果差异却非常大，这是哪些因素造成的？基因检测的频率是什么，了解基因突变的频率对治疗有什么指导？靶向用药治疗过程中产生了耐药，背后的耐药机制有哪些原因？还有……

癌症的治疗进展非常快，知识量更新非常巨大，抗击癌症的路上，分享更多知识给到论坛，争取更多有效的治疗时间，并就许多问题共同探讨，基因上加一点，做温暖的科技！

恶性肿瘤十大特征

肿瘤细胞与组成人体各个器官的正常细胞同种来源，不同的是，肿瘤细胞的基因结构和功能的改变赋予了它们10大特殊的功能，从而使得它们能够在人体内纵横捭阖，所向披靡。
恶性肿瘤十大特征之1| 生长信号的自给自足
人体是一个极为复杂的系统，数以万计的细胞各司其职，在和谐统一的秩序中维护人体健康。就像军队中的令行禁止一样，细胞要想改变其现有状态，必须接收到一系列相关指令。在生物学中，这种指令被称为信号分子，信号分子通过与靶细胞上相应指令接收器（受体）结合，细胞状态才会发生改变。
但是，肿瘤细胞是截然不同的，它们会通过各种方式来改造自己，降低对生长信号的依赖性。一方面，肿瘤细胞可以自己合成生长所需的信号，获得自己发号施令的能力，不再依赖于外源性信号。另一方面，肿瘤细胞会大量表达其表面的信号接收器，富集周围微环境中的生长信号，进入生长状态。在ctDNA检测中，常见的EGFR激活突变和HER2扩增就属于肿瘤细胞生长信号的自给自足，因为正常情况下，EGFR和HER2需要生长因子刺激才会活化信号通路，促进细胞生长。
恶性肿瘤十大特征之2 | 逃避生长抑制
平衡是人体系统最重要的一个特点，人体内除了有生长信号外，还存在着生长抑制信号。在细胞分裂的不同阶段，有一些分子如同“巡警”一般，时刻监测着细胞的生长状况和周边环境。根据这些情况来决定细胞未来的命运：或是继续生长分化，或是仍然处于静止期，抑或衰老、凋亡。这样整个机体的细胞才能保持动态平衡的状态，有序地生长分化。比较典型的两个抑癌基因——RB和TP53，就扮演着“巡警”的角色，它们控制着细胞生长分化之路的关键节点。
对于恶性肿瘤细胞来说，如果想要扩大自己的地盘，不断地生长分化，必须逃避这些“巡警”分子的监控。他们主要策略就是通过基因突变使得这些“巡警”分子失去活性，从而逃避生长抑制。
恶性肿瘤十大特征之3 | 逃避细胞凋亡
凋亡是指机体为了维持内环境稳定，由一系列基因控制的细胞程序性死亡的过程，与细胞坏死不同，是主动死亡的过程，像花的自然凋落。逃避细胞凋亡几乎是所有类型的癌细胞都具有的能力。
负责细胞凋亡的信号分子大体上可以分为两类：一类如同上面提到的“巡警”分子—TP53，另一类则是负责执行凋亡，比如TP53会上调其下游基因BAX的表达，促进细胞凋亡。前者监控细胞内外环境，一旦发现不正常情况足以触发细胞凋亡，立即指挥后者执行。
细胞凋亡是人体防癌抑癌的主要屏障。在“巡警”分子眼中，癌细胞就是一种状态不正常的细胞。癌细胞逃避细胞凋亡的主要策略是通过基因突变使p53蛋白或其下游蛋白失活。统计显示在大约超过50%的人类癌症中发现p53蛋白的失活。
恶性肿瘤十大特征之4 | 无限增殖潜力
在细胞体外培养实验中，人们观察到，大多数正常细胞仅有60次左右的分裂能力。科学家已经证实，细胞的分裂能力与染色体末端的一段数千个碱基的序列有关，这段序列称为端粒。
每经一个分裂周期，这段序列就会减少50～100个碱基，随着分裂次数的渐多，端粒会变得越来越短，最终的后果就是端粒消 失，后果就是其无法再保护染色体的末端，染色体也就无法顺利复制，进而导致细胞的衰老死亡。
端粒的形成依赖于端粒酶，端粒酶的主要功能是为端粒末端添加所需要的碱基，保证端粒不会因为复制而缩短。研究结果表明，几乎所有类型的恶性肿瘤细胞都能够过量表达端粒酶，维持端粒，达到不停分裂、无限增殖的目的。
恶性肿瘤十大特征之5 | 新生血管形成
对细胞来说，血管就是最重要的“粮道”。这个“粮道”对于细胞正常生长并良好地行使其功能是如此重要，以至于一个细胞与其最近的毛细血管的距离不能超过100微米。通常情况下，在组织形成和器官发生这些生理过程中，血管生成是受到精细调控的，而且这种情况下的血管形成也是暂时的，当上述生理过程结束后，血管生成即会停止。促进和抑制血管生成的信号分子通常处于“势均力敌”的平衡状态。
恶性肿瘤细胞获得持续的新生血管形成能力就是通过打破这种平衡状态开始的。科学家们在许多类型的肿瘤当中发现，一些促进血管形成的信号分子如VEGF（血管内皮生长因子)和FGF（成纤维细胞生长因子）的表达水平都远高于相应的正常组织对照，而一些起抑制作用的信号分子的表达则下降。
恶性肿瘤十大特征之6 | 侵袭和转移
人体中的正常细胞除了成熟的血细胞外，大多数需要粘附在特定的胞外基质上才能存活并正常行使功能，比如上皮细胞及内皮细胞，一旦脱离细胞的胞外基质则会发生细胞凋亡。将这些细胞粘附在胞外基质或互相粘附在一起的分子称为细胞粘附分子，它们如同“锚”把船固定在港口一样发挥着锚定的作用。
E-钙粘素是目前研究最深入的细胞粘附分子之一。它在上皮细胞中广泛表达，而在大多数上皮细胞癌中则发现活性的丧失，而丧失的方式有多种多样，如基因水平上突变导致的失活及蛋白水平上活性区域被降解导致的失活等。
科学家们认为E-钙粘素在上皮细胞癌中发挥着广泛的抑制癌细胞侵袭和转移的作用。它的活性的丧失标志着恶性肿瘤细胞在获得第六种武器的道路上迈出了重要的一步。
恶性肿瘤十大特征之7 | 免疫逃逸
固有免疫是机体在种系发育和进化过程中形成的天然免疫防御功能，也称为非特异性免疫。主要包括单核巨噬细胞，自然杀伤细胞和中性粒细胞等。适应性免疫是体内抗原特异性T、B淋巴细胞接受抗原刺激后，自身活化、增殖、分化为效应细胞，产生一系列生物学效应。
免疫系统具有免疫监视功能，当体内出现恶变细胞时，免疫系统能够识别并通过免疫机制特异地清除这些“非己”细胞，抵御肿瘤的发生发展。无论是固有免疫还是适应性免疫系统在肿瘤清除中都起着重要的作用。
而实体肿瘤却都具有不同的逃逸人体免疫系统监视的功能，从而确保它们不被免疫细胞（如T细胞，B细胞，巨噬细胞和自然杀伤细胞）杀伤和清除。
细胞毒性T细胞抗原4（CTLA-4）和程序性死亡受体1（PD-1）及其受体PD-L1是免疫检查点的重要组成部分。免疫系统通过这些免疫检查点分子来维持自身耐受性，负向调节免疫反应，保护机体免受免疫系统的攻击。
恶性肿瘤十大特征之8 | 基因不稳定性和易突变
肿瘤是一种基因病，其复杂的发生过程可以归根于肿瘤细胞基因的不断突变。在需要大量基因突变来诱导肿瘤发生时，肿瘤细胞常常会提高其对可诱导基因突变物质的敏感性，从而加快它们基因突变的速度。在该过程中，由于某些稳定和保护DNA的基因发生突变，会显著提高癌症的发生几率。
尽管在不同类型的肿瘤中基因突变的种类不同，但均可以发现大量基因的功能缺失，上述现象提示我们，肿瘤细胞的一大重要特征就是固有的基因组不稳定性。
DNA损伤修复和DNA错配修复是维持基因组DNA稳定性的重要措施，相关基因突变会提高肿瘤患病风险。比如，与遗传性乳腺癌/卵巢癌综合征相关的BRCA1和BRCA2基因，主要参与DNA损伤修复过程（修补匠）；与遗传性非息肉性结直肠癌（林奇综合征）相关的MLH1、MSH2、MSH6和PMS2基因，主要参与DNA错配修复过程（纠错员）。
恶性肿瘤十大特征之9 | 引发炎症反应
在过去数十年中，大量的研究证实了炎症反应（注：主要由固有免疫细胞引起）和癌症发病机理之间的关系。炎症细胞存在于多数的肿瘤组织中，是肿瘤微环境的重要组成部分，会分泌细胞因子和趋化因子，从而为肿瘤微环境提供各种生物激活分子。
比如炎症细胞在肿瘤转移过程中发挥重要作用，肿瘤相关的巨噬细胞会分泌炎性细胞因子IL-6，IL-6与相应受体结合后，激活STAT3信号通路，上调相关转录因子的表达，启动EMT过程；分泌蛋白酶MMPs，破坏组织结构和基底膜，有利于肿瘤细胞生长、浸润和转移。
炎症细胞还会分泌其它刺激因子，如生长因子（可维持癌细胞的增殖信号）、生存因子（可抑制细胞死亡）、促血管生成因子和细胞外基质修饰酶（可利于血管生长，癌细胞浸润和转移）、以及其它诱导信号（可激活EMT和癌细胞的其它一些特征）。此外，炎性细胞还会分泌一些化学物质（如ROS）加快临近癌细胞的基因突变，加速它们的恶化过程。
恶性肿瘤十大特征之10 | 调控细胞代谢
ATP是细胞中的能量通货，用于储存和传递化学能。细胞中产生ATP主要通过胞液中进行的糖酵解和线粒体中进行的氧化磷酸化两种途径。正常情况下，细胞代谢活动所需要的能量主要由线粒体氧化磷酸化产生的ATP提供，在这种情况下需要氧气的供应，并且在有氧条件下，糖酵解会受到抑制。
但是，与上述正常细胞不同，即便在有氧气的条件下，肿瘤细胞也会通过调控，使其能量主要来源于糖酵解的代谢方式，这被称为“有氧糖酵解”。
目前已经有研究证实了在神经胶质瘤和其它种类的癌细胞中，异柠檬酸盐脱氢酶（IDH3α）功能上的突变也许和细胞能量代谢方式的改变有关。IDH3α下调减少α-酮戊二酸的有效水平，导致PHD2抑制和HIF-1α稳定化，HIF-1α累积会增加葡萄糖摄取，上调糖酵解酶在有氧条件下的表达，并由此促进糖酵解。

这些特征用在治疗上有什么作用呢？好像看到了EGFR，还有免疫逃逸是不是跟免疫治疗能挂钩？

你好！上面的肿瘤十大特征是引用了肿瘤学经典文献《Hallmarks of Cancer: The Next Generation》总结的。
所谓知己知彼，才能百战不殆。尤其对于肿瘤，从根本上认识肿瘤的特性，可以解释很多现象，也可以寻找治疗办法。
这10大特性中，有一部分已经被应用于临床治疗了，另外一些虽然目前尚未有很好的解决办法，但期望在将来可以攻克。
1、生长信号的自给自足，逃避生长抑制：从基因层面来说，这是肿瘤旺盛生命之源。（我们医疗的目的之一就是尽可能地延长人类的寿命，如果我们的基因有这种特性有多好啊。）生长信号通路激活是肺癌、乳腺癌中最常见的基因突变情况，很多靶向药也是针对这个信号通路的，如EGFR-TKIs（易瑞沙、特罗凯、凯美纳、9291等）、抗HER2药物（赫赛汀），而生长信号旁路、下游通路的激活将会导致耐药。
2、新血管生成：临床上用的抗血管生成药物，如贝伐单抗、舒尼替尼、索拉非尼等，主要作用机制是抑制肿瘤新血管生成，关闭肿瘤细胞生长所需的"粮道"。
3、免疫逃逸：今年在肺癌中获得突破性进展的免疫治疗，就是针对肿瘤这一特性的。通过抗PD-1、PD-L1药物与免疫细胞或肿瘤细胞结合，除去肿瘤细胞的“伪装”，让免疫系统准确识别和杀伤肿瘤细胞。（在最新版的NCCN指南中，免疫治疗已经荣升为非小细胞肺癌的一线治疗方案了哦。）
4、细胞能量异常：临床上PET正是利用肿瘤的葡萄糖高代谢这一特性来发现肿瘤的，我们现在已经利用这一点来发现肿瘤，是否有一天我们可能从能量的角度来干预肿瘤呢？
5、促进肿瘤的炎症：对于肿瘤炎症这一点似乎临床上关注得少，炎症是机体对肿瘤侵袭的一种反应，这种反应是好是坏呢？是应该增强还是抑制呢？对我们发现肿瘤或治疗肿瘤有什么帮助？这些问题有待继续关注。
或许肿瘤细胞本身不是坏东西，可能是一个顶级高手，具备各种武功，而我们人类在与他交锋的过程中不断的学习，不断的进步，寻找驾驭他的方法。

谢谢你提供的相关信息！有两个问题继续请教：
1）外周血液里是不是癌细胞可能会不够呢？这样检测的结果会不会不准？
2）这个检测有效期是多久？换言之肿瘤也在变异，这种检查结果也不能一劳永逸吧？多长时间还要重新再检测？

donglei 发表于 2016-11-23 10:23
谢谢你提供的相关信息！有两个问题继续请教：
1）外周血液里是不是癌细胞可能会不够呢？这样检测的结果会 ...

你好！你的2个问题是指用血液做肿瘤基因检测的情况是吗？
首先回答第一个问题：
1）液体活检。
液体活检（Liquid Biopsy）是相对于手术活检和穿刺活检的一种检测方法，主要包括3个方向分析游离的肿瘤DNA（ctDNA）、考察血液中完整的肿瘤细胞(CTC)和收集由肿瘤细胞释放出的外泌体，从而替代了从肿瘤本身提取组织。与传统的组织活检相比有着迅速、便捷、损伤性小、可重复性地抽取肿瘤样本等众多优点。一方面，可能可以为更多的病人实现个体化治疗，尤其是无法手术或穿刺活检的患者。另一方面，由于可重复性地检测，临床医生可以用它来监测肿瘤对治疗的反应，预测肿瘤复发。从长远角度来看，液体活检还能够帮助医生在患者未出现任何症状的时候发现最初期的肿瘤。
液体活检的3个方向成熟程度不一样，ctDNA检测是近年来发展最迅速的一个。
2）ctDNA检测
循环肿瘤DNA （circulating tumor DNA，ctDNA）是由肿瘤细胞释放到血液循环系统中的DNA， 是拥有广泛应用前景的一类肿瘤标记物。具有几个主要特点：1）片段短小：150-200bp；2）半衰期短：约2小时，可以实时反映体内肿瘤情况；3）含量变化大：ctDNA占cfDNA比例0.01%~90%不等，但大多数情况下含量较低；4）含量与肿瘤类型、肿瘤负荷及肿瘤进展相关。
因为片段短小，而且含量较低，因此对检测技术的要求是比较高的。通过超高深度测序和纠错技术，可以比较准确地检出肿瘤的突变。（如何准确地检出肿瘤特有的基因突变，是基因检测的核心环节，如果大家感兴趣，我可以在后面给大家再讲讲）

donglei 发表于 2016-11-23 10:23
谢谢你提供的相关信息！有两个问题继续请教：
1）外周血液里是不是癌细胞可能会不够呢？这样检测的结果会 ...

第2个问题
2）这个检测有效期是多久？换言之肿瘤也在变异，这种检查结果也不能一劳永逸吧？多长时间还要重新再检测？

这是个很好的问题。
比如，易瑞沙、特罗凯和凯美纳等一代EGFR靶向药物以出色的疗效改善了携带EGFR基因突变患者的生活质量，然而遗憾的是，服用靶向药物的肺癌患者会在一年左右产生耐药。随后研究证明肿瘤细胞进化出新的突变基因来化解 TKI 的封锁。比如关于EGFR耐药，第一常见的T790M 基因突变引起空间构象改变，导致一代 TKI 无法有效封锁住原有的信号通道，使得 EGFR 重新激活。第二常见的cMET 旁路激活造成信号改道，导致一代TKI封锁失效。又如，可能出现的KRAS突变位于EGFR下游，由于下游持续激活，封锁上游 EGFR 变得无济于事。敏感-耐药-新的敏感-耐药，往往会无穷无尽循环下去。

既然服用靶向药物逃脱不了耐药的命运，那么及时知道耐药发生的时间点，根据耐药位点及时更换靶向药物就变得十分关键。
可以选择做相关的基因检测，实时监测肿瘤治疗过程中基因的动态变化，及时确定肿瘤的获得性耐药机制，跟临床上CT等影像的结果综合起来分析，可以辅助医生综合评估诊疗结果，确定最佳治疗及用药方案。

具体间隔时间多长，建议可以结合现用药物的平均耐药时间+个体情况（是否有进展的迹象）+临床复查结果来评估，咨询专业临床医生。

如何准确识破肺癌关键基因？
——逐一盘点肺癌通路基因及其检测方法

肿瘤从本质上来说是一种基因病，由基因突变引起，是无法修复的基因突变逐渐累积的结果。肿瘤的发生原因是：突变的数量和突变发生在关键基因上，使得修复机制无法将突变修复和清除而使得突变不断累积而造成的。但并不是所有基因发生突变都会引起肿瘤，与肿瘤发生发展相关的关键基因包括原癌基因和抑癌基因。
肺癌是我国发病率和死亡率最高的癌症。2015年预计有73.33万人被诊断为肺癌，有61.02万人死于肺癌，平均每天有2000人被诊断为肺癌。
肺癌的主要信号通路基因及其靶向药物也是目前研究比较清楚的。

常见通路基因突变集药物

注：NCCN推荐这一列，列举的是尚未被FDA批准用于肺癌，但已经写入NCCN肺癌指南的药物。

这些基因主要都是通过激活细胞生长信号来达到肿瘤生长的目的的。信号通路示意图如下。以EGFR作为参考通路来说的话，其他平行的基因比如ALK、ROS1、HER2、MET就称为EGFR的旁路，RAS-RAF-MEK称为EGFR的下游信号通路。旁路和下游信号通路的激活都将导致耐药。

信号通路

然而这些基因在肺癌中出现的概率并不是相同的，根据一项对中国非小细胞肺癌患者致癌驱动基因突变的研究（2000例），结果显示肺腺癌的常见基因突变如下图：

肺腺癌分子分型

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4741453/

下面我们将逐一剖析这些常见基因的机制及其检测方法

最常见的基因突变——EGFR
EGFR在人体中究竟是怎么工作的呢？   
EGFR“工作职责”：EGFR基因编码一种细胞表面的蛋白质“表皮生长因子受体”，其广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞等细胞表面，存在于很多正常上皮组织中，如：皮肤，毛囊。正常情况下，当表皮生长因子家族的其中之一与EGFR结合，就会激活EGFR下游的信号通路来调控细胞的生长、增殖、分化过程。简单来说，就好比是一个生产线的订单管理系统，根据外界下达订单（表皮生长因子）后，通知生产线进行批量生产（细胞生长、增殖、分化）
然而
①   EGFR基因突变会导致这种蛋白质异常激活，进而导致下游信号通路异常激活，最终造成细胞异常增殖、生长。（订单系统出错，重复下单）
②   EGFR基因扩增，会导致产生过多的表皮生长因子受体蛋白，进而导致细胞过度生长、分裂。（由1个订单系统变成多个订单系统，订单翻倍）

针对EGFR的靶向药都有哪些？
阻止 EGFR突变基因的表达可以遏制肿瘤细胞的生长，FDA已经批准了一些针对EGFR基因突变来治疗癌症的靶向药，如：
第一代EGFR-TKI：吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼
第二代EGFR-TKI：阿法替尼
第三代EGFR-TKI：AZD9291（Osimertinib）
1．是不是只要EGFR基因突变就可以考虑选用这些药呢？
FDA批准了吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼治疗携带EGFR基因19号外显子缺失或21号外显子L858R突变的非小细胞肺癌患者。
2．对于携带EGFR基因19号外显子缺失的肺癌患者脑转移，临床研究显示，厄洛替尼的入脑能力更好。
3．如果患者携带EGFR基因20号外显子L861Q突变，还可以选用上面几种靶向药吗？
事实上，EGFR基因20号外显子L861Q突变对于第一代EGFR-TKI的反应相对较差，同时，多个临床试验表明相对第一代EGFR-TKI，第二代EGFR-TKI阿法替尼对携带L861Q等少见突变的肿瘤细胞效果更好。

靶向药一劳永逸？
通过上面的介绍，我们知道了EGFR基因不同位点突变可能选择不同的靶向药，并且在临床用药过程中需考虑患者的具体情况，比如是否存在脑转移等。然而，患者的靶向治疗之路，这仅仅是开始，肿瘤细胞往往在“与时俱进”，单看EGFR基因：
1， 虽然EGFR基因19号外显子缺失是EGFR-TKI敏感突变，但19号外显子D761Y则是EGFR-TKI耐药突变；
2， 虽然EGFR基因20号外显子V765A是EGFR-TKI敏感突变，但同是20号外显子的T790M则是第一、二代EGFR-TKI耐药突变；
不过，EGFR基因20号外显子T790M耐药突变对第三代EGFR-TKIAZD9291敏感。这么说，患者耐药也不怕了？然并卵，与T790M呈顺式构型的C797S耐药突变、20号外显子的插入突变等则对目前所有EGFR-TKI耐药。事实上，EGFR基因20号外显子L861Q突变对于第一代EGFR-TKI的反应相对较差，同时，多个临床试验表明相对第一代EGFR-TKI，第二代EGFR-TKI阿法替尼对携带L861Q等少见突变的肿瘤细胞效果更好。
下面来直观感受下肿瘤基因突变的“与时俱进”：
该患者基因检测出EGFR基因19号外显子缺失，使用一代EGFR-TKI厄洛替尼有效，一段时间后患者耐药进展，并且基因检测出EGFR基因T790M突变，然后换用三代EGFR-TKI有效，可是一段时间之后的基因检测结果……

该患者居然出现了一、二、三代EGFR-TKI都耐药的与T790M呈顺式构型的C797S突变。而这个案例只是是肿瘤基因突变进化史的冰山一角。

EGFR基因突变检测方法
1）ARMS-PCR
目前欧盟及中国CFDA批准用于临床的血液检测方法是ARMS技术，也是血液EGFR突变检测专家共识推荐的技术。
优点：快捷，灵敏度高，检出限达1%，有商业试剂盒，操作简单；
缺点：只能检测已知突变，检测基因数目少。
基本原理是，如果引物的3′端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计3条引物，其3′端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。此法已用于多种疾病的点突变的检测.


2）NGS
NGS（二代测序）技术：测序成本、技术门槛较高，信息分析、解读过程较难，但可检测未知突变且检测基因数量不受限制，在肿瘤治疗的后续耐药突变监测与研究中很有潜力。

　        速度        灵敏度        价格        检测范围        技术普及度
ARMS        相对快捷        1%        相对较低        只能检测已知突变        较易
NGS        相对较慢        0.1%        相对较高        可检测未知突变        较难

“重出江湖”基因——“ALK”
正常的ALK在人体中是怎么工作的？
ALK最早是在淋巴瘤中被发现，因此也得名于间变性大细胞淋巴瘤这种特殊少见的肿瘤。ALK基因编码间变性淋巴瘤激酶，与EGFR类似，位于细胞膜表面，调控细胞生长。研究发现ALK基因可能在中枢和外周神经系统的发育中起作用，主要在胚胎期活跃。当神经系统发育完善后，ALK基因通常就进入休眠状态，因此正常情况下成人的ALK基因是不表达的。然而肿瘤细胞为了让ALK基因“重出江湖”可谓绞尽脑汁72变。

1、突变与药物
ALK变异主要包括融合突变、点突变、扩增突变这几种。
1）融合突变。——鱼目混珠术
在非小细胞肺癌中，ALK重排占3%-7%，其中以EML4-ALK融合突变为主， ALK基因也可以合其他基因融合，如：KIF5B基因、TFG基因、NPM基因等。
融合突变是怎么产生的？EML4和ALK两个基因序列分别在2号染色体短臂上2p21和2p23位置，EML4基因5’端与ALK基因的3’端融合，从而形成EML4-ALK融合基因。

融合之后的怎么导致异常的？由于EML4在体内表达是活跃的，融合后的ALK作为EML4的“尾巴”，利用EML4基因的表达一起表达（搭便车）。在ALK高表达的情况下，其蛋白即使没有胞外配体的结合，也可以自己形成二聚体，然后启动自身磷酸化、激活下游信号通路、细胞疯狂地生长。
针对ALK融合，目前有克唑替尼、色瑞替尼等多个靶向药物获批上市。这些靶向药物对于有ALK融合的肺癌显示出了非常好的效果！

2）点突变。
ALK在少数情况下可能发生点突变。研究发现，在针对ALK融合阳性且使用靶向药后出现耐药的患者中，发现部分患者存在ALK点突变，是ALK-TKI耐药的原因之一。
3）扩增
ALK基因在少数情况下也可能发生扩增，与EGFR扩增类似，通过增加“订单系统”来增加“产量”，激活下游信号通路，刺激细胞生长。

2、ALK基因检测方法
临床所说的ALK阳性主要指ALK融合突变，常用方法为ALK融合蛋白IHC检测、ALK融合突变RT-PCR检测、FISH检测。
1）ALK融合基因的检测方法之FISH
FDA批准的ALK融合基因突变的临床检测方法有3种，包括RT-PCR，FISH和IHC，截止目前，FISH法检测ALK融合基因的方法还是临床上检测ALK融合基因突变的金标准。FISH方法的检测原理是在ALK基因的3’端，设计红色的荧光探针，在ALK基因的5’端，设计绿色的荧光探针，然后对肿瘤样本做FISH荧光探针杂交检测。如果检测的结果中，红色光点和绿色光点连在一起，将显示黄色光点（如左图），同时说明ALK基因没有断裂，也就是ALK基因没有发生融合突变，反之，如果红色光点与绿色光点是分离的2个光点（如右图），那么就说明ALK基因发生了断裂，也就是ALK基因存在融合突变。


2）ALK融合基因检测方法之RT-PCR（多重逆转录聚合酶链反应）
RT-PCR法也是临床上使用的检测方法。其原理是先把肿瘤组织中的RNA逆转录成单链cDNA，然后再用针对融合基因的PCR探针进行实时荧光定量PCR扩增。如果荧光定量PCR能探测到荧光，就说明有ALK基因融合突变，如果不能探测到荧光，则说明样本中没有ALK基因融合突变，或突变比例很低，低于试剂盒的检测灵敏极限。

因为它能精确识别5’端的融合伙伴基因，所以RT-PCR具有高度特异性且假阳性率很低。但是存在假阴性，因为RT-PCR对RNA样本质量要求比较高，如果RNA存在降解，检测的灵敏度将会受影响， 比如：存档的石蜡包埋标本中很少有高质量的mRNA。
3）ALK基因的检测方法之NGS
二代测序，由于其原理是检测基因的整体情况，因此既可检测融合突变，又可准确识别点突变、拷贝数扩增。此外，还适用于各种样本类型，组织、血液、胸水、石蜡切片都不在话下。
下面以融合为例，解释二代测序检测ALK融合的检测原理：